Permettre l’analyse fonctionnelle de l’immunologie cellulaire
Dans des conditions optimales, le test ELISpot (enzyme-linked immunosorbent spot) permet de visualiser plusieurs produits sécrétés par une seule cellule réactive. Ainsi, l’ELISpot fournit à la fois des informations qualitatives (type de protéine immunitaire) et quantitatives (nombre de cellules réactives). Grâce à la sensibilité inégalée de ce test, l’analyse de la fréquence de populations cellulaires rares (par exemple, les réponses spécifiques à un antigène), autrefois impossible, est désormais relativement facile. Les améliorations récentes dans la conception de microplaques multipuits, y compris l’utilisation de membranes avec une fluorescence de fond réduite, ont renforcé l’application généralisée des tests EliSpot.
Lorsque la sensibilité du test, la facilité d’utilisation et le coût sont pris ensemble en considération, la plateforme EliSpot est probablement le choix supérieur pour le développement de tests multifonctionnels des cellules T destinés aux communautés de recherche, thérapeutiques et diagnostiques.
La popularité de ce test a connu un regain d’intérêt ces dernières années, alors que les chercheurs cherchent à mieux comprendre les réponses immunitaires dans diverses applications, notamment l’étude de la mémoire immunologique et le développement de vaccins.
Optimisation de l’ELISpot
Bien que les tests ELISpot permettent de déterminer la fréquence d’événements très rares, l’interprétation des données peut devenir ambiguë lorsque le nombre de taches dans les puits contenant l’antigène est faible, que les comptes de taches dans les puits témoins négatifs sont élevés et, en particulier, lorsque les deux se produisent simultanément. Ainsi, la tâche principale, même avant d’employer des analyses statistiques, doit être l’optimisation des paramètres de base du test et des réactifs afin de maximiser le rapport signal-bruit. Bien que l’utilisation de paires d’anticorps spécialement validées pour l’ELISpot soit essentielle au succès du test, une bonne considération et exécution d’un certain nombre d’autres étapes sont nécessaires pour garantir des performances optimales.
Choix de la plaque (membrane)
Les plaques à membrane PVDF (numéros de catalogue Merck : MSIPS4W10, MSIPS4510, MAIPSWU10, MAIPS4510) sont recommandées plutôt que le format en ester de cellulose mixte (numéro de catalogue Merck : MSHAS4510), en raison d’une légère amélioration de la fixation de l’anticorps de capture et de performances supérieures dans la détection des taches, en particulier pour les applications fluorescentes. L’unique inconvénient des plaques en PVDF est l’extrême hydrophobicité du matériau, une propriété pouvant nécessiter un pré-humidification à l’alcool avant l’ajout de l’anticorps de revêtement. Comme la membrane de cellulose mixte est hydrophile, les tests ELISpot peuvent être effectués sans pré-humidification.
Contrôles négatifs/positifs
Des contrôles appropriés sont essentiels pour mesurer les réponses spécifiques à l’antigène via ELISpot. Les contrôles négatifs consistent généralement en des cellules cultivées sans stimulus, tandis que des activateurs polyclonaux de cellules T sont couramment utilisés comme contrôles positifs pour confirmer la fonctionnalité des cellules et du test. Les contrôles positifs comprennent des anticorps anti-CD3/CD28, la phytohémagglutinine (PHA) et la concanavaline A (ConA). Ces activateurs induisent la sécrétion de nombreuses cytokines communes, notamment IFNγ, IL-2 (Th1), IL-4, IL-5, IL-10 et IL-13 (Th2).
Un autre contrôle courant est le pool de peptides CEF (cytomégalovirus, virus d’Epstein-Barr, virus de la grippe). Il se compose de multiples épitopes provenant de chacun des trois virus, auxquels la plupart des individus en bonne santé (~90 %) possèdent des cellules T CD8 réactives.
Comme nous ne pouvons présenter que certains aspects dans cet article, nous souhaitons vous renvoyer à notre ELISpot livre blanc, dans lequel le protocole du test sera discuté en détail, avec un accent sur les bonnes pratiques standard et le dépannage.
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