Invitrogen™ Kit de chargement LiveBLAzer™ FRET-B/G avec CCF2-AM

Arrière-plan :
Les dosages cellulaires GeneBLAzer™ emploient des formes d’esther perméantes aux membranes (CCF2-AM et CCF4-AM) des substrats de bêta-lactamase fluorescents et chargées négativement, CCF2 et CCF4. Ces esters lipophiles entrent facilement dans la cellule, où le clivage par des estérases cytoplasmiques endogènes les convertit rapidement en leurs formes chargées négativement, les piégeant ainsi dans le cytosol.

La détection des dosages GeneBLAzer™ repose sur la FRET. Chaque substrat est marqué par deux fluorophores qui forment une paire FRET efficace. En l’absence d’activité de la bêta-lactamase, l’excitation de la coumarine à 409 nm dans la molécule de CCF2 intacte conduit à la FRET dans la fluorescéine, qui émet un signal de fluorescence vert à 518 nm (figure 1). Cependant, en présence d’activité de la bêta-lactamase, le clivage de CCF2 sépare spatialement les deux colorants et perturbe la FRET, de sorte que l’excitation de la coumarine à 409 nm produit désormais un signal de fluorescence bleu à 447 nm. Ce signal bleu peut être facilement observé sous un microscope et détecté comme une augmentation de l’affichage du canal bleu sur les lecteurs de microplaques fluorescentes.

Les substrats CCF2-AM et CCF4-AM sont des composants de tests essentiels pour la plateforme GeneBLAzer™. Ces substrats sont entièrement compatibles avec la cytométrie en flux, ce qui accélère la sélection des clones. L’analyse ratiométrique des signaux bleu et vert réduit la variation de puits à puits en raison des différences en ce qui concerne le nombre de cellules et la charge du substrat, ce qui conduit à des valeurs de facteur Z´ élevées et à des coefficients de variation (CV) faibles.

Le CCF2-AM et le CCF4-AM diffèrent par deux carbones dans le pont reliant la portion coumarine à l’anneau de lactamines. Ils ont tous les deux des formes perméables à la membrane, estérifiées. Ils peuvent être utilisés pour des tests dans des cellules intactes. Le CCF4-AM comporte de meilleures propriétés de solubilité (solubles pendant >24 heures) que le CCF2-AM. Ainsi, il est mieux adapté aux applications de sélection. En outre, le CCF4-AM a une FRET un peu meilleure et donc un fond légèrement inférieur à celui du CCF2-AM.

Le CCF2-FA est fondamentalement le substrat CCF2 sans les esters trouvés dans la version AM. Le CCF2-FA est désestérifié et utilisé dans les applications de lysat cellulaire, évitant ainsi la charge à travers la membrane cellulaire et les étapes de désestérification. Les lysats cellulaires constituent la méthode privilégiée pour les applications utilisant des cellules contenant une paroi cellulaire. Le CCF2-FA peut également servir de contrôle pour acquérir les spectres d’excitation et d’émission pour les CCF2-AM et CCF4-AM.