Thermo Scientific™ Kinase polynucléotide T4 (10 U/μL)

Description

La polynucléotide kinase T4 (PNK T4) catalyse le transfert du phosphate gamma de l’ATP au groupe 5’-OH des ADN et des ARN simple et double brin, des oligonucléotides ou des 3’-monophosphates de nucléoside (réaction prospective). La réaction est réversible. En présence de l’ADP, la polynucléotide kinase T4 affiche une activité de phosphatase de 5’ et catalyse l’échange des groupes de phosphate entre les 5’-P-oligo-polynucléotides et l’ATP (réaction d’échange).

L’enzyme est également une phosphatase de 3’.

• Active dans les tampons des enzymes de restriction, de la RT et de l’ADN ligase T4.
• Source : Cellules d’E. coli porteuses d’un gène pseT cloné du bactériophage T4
• Poids moléculaire : L’enzyme est un homotétramère. Elle est constituée de quatre sous-unités identiques de 28,9 kDa

• L’absence d’endo- et d’exo-désoxyribonucléases, et de ribonucléases a été confirmée par des tests de qualité appropriés. Testé fonctionnellement pour le marquage des terminaisons 5' d’ADN

• Cellules d’E.coli porteuses d’un gène pseT cloné du bactériophage T4

• L’enzyme est un homotétramère. Elle comprend quatre sous-unités identiques de 28,9 kDa

• Une unité d’enzyme transfère 1 nmol du phosphate gamma de l’ATP sur le groupe 5’-OH de l’ADN en 30 min, à 37°C
• L’activité enzymatique est dosée dans le mélange suivant : Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), MgCl₂ 10 mM, DTT 5 mM, ADN 5’-OH 0,5 mM, ATP 0,05 mM et [gamma-³³P]-ATP 0,1 MBq/ml

• L’enzyme est fournie sous la forme suivante : Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), KCl 25 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 2 mM et glycérol 50 % (v/v)
• Tampon de réaction A 10X (réaction prospective) : Tris-HCl 500 mM (pH 7,6 à 25°C), MgCl₂ 100 mM, DTT 50 mM, spermidine 1 mM
• Tampon de réaction 10X B (pour la réaction d’échange) : Imidazole-HCl 500 mM (pH 6,4 à 25°C), MgCl₂ 180 mM, DTT 50 mM, spermidine 1 mM et ADP 1 mM
• Solution contenant 24 % de PEG : 24 % (p/v) de polyéthylène glycol 6000
Inhibition et inactivation :
• Inhibiteurs : chélateurs de métaux, ions de phosphate et d’ammonium, KCl et NaCl à une concentration supérieure à 50 mM
• Inactivation thermique à 75°C pendant 10 min ou par ajout d’EDTA

Recommandées dans les cas suivants :

Marquage des terminaisons 5’ d’acides nucléiques (3, 4) à utiliser comme sonde pour l’hybridation et la cartographie de transcripts, comme marqueur pour des électrophorèses sur gel ou comme amorce pour le séquençage d’ADN et la PCR ; 5’-phosphorylation d’oligonucléotides, de produits de PCR et d’autres molécules d’ADN ou d’ARN avant la ligature ; phosphorylation d’amorces pour la PCR ; détection de modifications de l’ADN par la méthode de post-marquage au 32P (5, 6) ; élimination des groupes 3’-phosphates (2)

Remarque :

Le polyéthylène glycol (PEG) et la spermidine améliorent la vitesse et l’efficacité de la réaction de phosphorylation (7). Le PEG est utilisé dans le mélange de la réaction d’échange. La polynucléotide kinase T4 étant inhibée par les ions ammonium, utiliser de l’acétate de sodium pour précipiter l’ADN avant la phosphorylation (1, 2).