Les défis de l'ADN plasmidique utilisé pour la biopharmacie et la thérapie génique
Introduction
La demande d'ADN plasmidique de haute qualité et ultrapur a considérablement augmenté en réponse aux avancées rapides de son utilisation. De nouvelles applications telles que le développement de vaccins à base d'ARN messager, la production d'anticorps et la thérapie génique à l'aide de vecteurs viraux, requièrent toutes de l'ADN plasmidique comme matériau de départ important. Un aspect particulièrement délicat de ces procédures est la présence d'endotoxines, qui sont des contaminants fréquents dans l'ADN plasmidique extrait des bactéries. Alors que de nombreuses applications typiques en aval, telles que le séquençage et le clonage, ne sont pas affectées par la présence de ces molécules, les endotoxines sont très préoccupantes dans les applications biopharmaceutique et thérapie génique.
Quels sont les effets biologiques des endotoxines ?
Les endotoxines sont des lipopolysaccharides situés dans la membrane externe des bactéries Gram-négatives. In vivo, les endotoxines se lient aux récepteurs à la surface des cellules immunitaires et les incitent à sécréter des cytokines pro-inflammatoires (par exemple, des facteurs de nécrose tumorale et des facteurs d'activation des plaquettes) et à produire des médiateurs de l'inflammation tel que l'interleukine (IL)-1 et l'IL-6. Lorsque les niveaux d'endotoxines dépassent la capacité du système immunitaire, celui-ci peut réagir de manière excessive et provoquer une réponse immunitaire intense, c'est-à-dire une forte fièvre et, dans le pire des cas, un choc septique voire la mort par défaillance d'un organe. Des niveaux plus faibles d'endotoxines provoquent également de nombreux effets biologiques, notamment de la fièvre, une résistance altérée aux infections bactériennes et une leucopénie suivie d'une leucocytose.
L'intensité de cette réponse immunitaire démontre la nécessité de disposer d'ADN plasmidique exempt d'endotoxine pour les approches de thérapie génique. Cependant, la thérapie génique n'est pas la seule application en aval affectée par la présence d'endotoxines dans l'ADN plasmidique. Les endotoxines ont également été décrites comme ayant divers effets sur les cultures cellulaires, notamment une cytotoxicité accrue et une altération de la croissance, de la différenciation et de la production de protéines des cellules. Les cellules sensibles réagissent fortement à des concentrations d'endotoxines même très faibles dans l'ADN plasmidique, entraînant une réduction significative de l'efficacité de la transfection ou des résultats erronés dans les analyses d'expression génique. En général, la présence d'endotoxines dans l'ADN plasmidique s'avère être une variable non contrôlable, nécessitant ainsi leur élimination pour une interprétation fiable des données et une reproductibilité des résultats.
Comment choisir le bon produit pour l'élimination des endotoxines ?
Le niveau de contamination par les endotoxines de l'ADN plasmidique dépend fortement de la méthode de purification utilisée. Bien qu'il n'existe probablement pas d'absence totale d'endotoxines, on s'accorde généralement à considérer l'ADN purifié (avec des valeurs inférieures à 0,1EU/μg d'ADN) comme exempt d'endotoxines (EF). La technologie de pointe utilisée pour atteindre de telles puretés élevées dans un système pratique de purification des plasmides (à partir de cellules bactériennes) est basée sur la chromatographie d'échange d'anions et nécessite des systèmes tampons spéciaux brevetés.
Pourquoi choisir Macherey-Nagel™ pour ces applications d'ADN plasmidique?
Depuis le développement de l'isolement des plasmides en kit il y a plus de 35 ans, Macherey-Nagel™ a été un pionnier des solutions rapides et hautement fiables pour la purification de l'ADN plasmidique. Les kits Macherey-Nagel™ NucleoBond™ Xtra EF combinent une excellente méthode de chromatographie d'échange d'anions à un système tampon rapide et efficace pour l'élimination des endotoxines. Ils exploitent une technologie exclusive qui masque les endotoxines et les empêche de se lier à la matrice d'échange d'anions. Cette procédure est très efficace et pratique, car les additifs sont fournis dans des tampons prêts à l'emploi et les étapes d'incubation supplémentaires sont évitées. Ces kits NucleoBond™ EF permettent d'obtenir des concentrations d'endotoxines aussi faibles que 0,01-0,1EU/μg d'ADN, bien en dessous du seuil EF. L'ADN plasmidique EF résultant convient même aux applications difficiles et offre la plus grande pureté possible.
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